Transfection de protoplastes d’Arabidopsis avec un clone infectieux du virus de la sharka du prunier (PPV) pour étudier les premiers événements moléculaires associés à l’infection par le PPV

La mise au point de nouvelles stratégies pour lutter contre les maladies virales des plantes repose sur une meilleure compréhension des interactions moléculaires virus hôte. Nous présentons ici un protocole facile, efficace et reproductible d’isolement et de transfection des protoplastes d’Arabidopsis pour étudier l’infection par un potyvirus, le virus de la sharka du prunier (PPV), et la réplication de ce virus. La macérozyme et la cellulose ont été utilisées pour libérer les protoplastes des tissus foliaires d’Arabidopsis, et l’absorption de l’ADN à l’aide de polyéthylène glycol a été utilisée pour la transfection d’un clone infectieux du PPV. La viabilité des protoplastes a été surveillée par coloration avec du diacétate de fluorescéine, et l’efficacité de la transfection a été estimée à l’aide de l’expression transitoire de la protéine fluorescente verte. Le protocole a permis d’obtenir une production de 95 % de protoplastes du mésophylle viables et un taux de réussite de la transfection de 35 %. Le système a ensuite été utilisé dans le cadre d’une expérience chronologique pour étudier l’accumulation d’ARN viral du PPV. Nous avons constaté que, trois heures après la transfection, l’ARN viral augmentait d’environ 150 fois dans les protoplastes transfectés et s’accumulait progressivement pour atteindre un maximum 12 heures après la transfection. L’ARN viral a ensuite diminué considérablement 24 heures après la transfection, se retrouvant à 40 % de son niveau maximal. Compte tenu de la disponibilité de microréseaux de génomes entiers et d’autres ressources génomiques des Arabidopsis, le système d’infection synchronisée d’une cellule unique (protoplaste) sera utile pour élucider les premiers événements moléculaires associés à l’infection par le PPV. © de la Couronne, 2006.