Characterization of mucosa-associated bacterial communities of the mouse intestine by terminal restriction fragment length polymorphism: Utility of sampling strategies and methods to reduce single-stranded DNA artifacts

Le T-RFLP (polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux) est une technique moléculaire utilisée dans l’analyse comparative de la structure et de la dynamique des communautés microbiennes. Nous avons évalué trois méthodes d’échantillonnage visant à récupérer l’ADN des communautés bactériennes associées à la muqueuse intestinale des souris (agitation mécanique avec du PBS, lavage à la main avec du PBS contenant du Tween 80 et extraction directe de l’ADN à partir de bouchons muqueux). Nous avons également vérifié l’utilité de deux méthodes (fragment de Klenow et nucléase de haricot) pour réduire les artéfacts causés par l’ADN à simple brin. L’analyse T-RFLP a indiqué que diverses communautés bactériennes sont associées aux muqueuses de l’iléon, du cæcum et du côlon descendant de la souris. Nous n’avons pas observé de différence significative dans la structure des communautés bactériennes obtenues par agitation mécanique et extraction directe de l’ADN, et ce dans toutes les parties de l’intestin, mais nous avons obtenu une communauté moins diversifiée dans le côlon avec la méthode du lavage à la main. Bien que l’emploi du fragment de Klenow et de la nucléase de haricot soit censé éliminer les artéfacts causés par l’ADN à simple brin (c. à d. pseudo-fragments de restriction terminaux), ni l’une ni l’autre des méthodes ne s’est révélée avantageuse pour caractériser les communautés bactériennes associées à la muqueuse du cæcum des souris. Notre étude a montré que l’agitation mécanique et l’extraction directe à partir de bouchons muqueux donnent des résultats équivalents en ce qui concerne l’ADN des communautés bactériennes des muqueuses de l’intestin grêle et du gros intestin des souris. Toutefois, la dernière méthode s’est révélée supérieure pour des raisons logistiques. Nous avons également appliqué un ensemble de méthodes statistiques différentes pour analyser les données de T-RFLP, y compris la détection statistique des vrais pics, l’analyse de la variance du nombre de pics et le test de signification des groupes, qui nous ont permis d’améliorer de façon quantitative l’interprétation des données de T RFLP.