Une nouvelle protéase codée par l’ARN2 est nécessaire, en plus de la protéase de type 3C codée par l’ARN1, pour le traitement des polyprotéines du virus de la marbrure du fraisier

ObjectifsLa maladie du dépérissement du fraisier est apparue comme un problème important pour la production de fraises dans l’Est du Canada et est probablement causée par les effets synergiques d’infections virales mixtes. Le virus de la marbrure du fraisier (SMoV, famille des Secoviridés) est l’un des virus les plus répandus associés à la maladie. Comme chez les autres membres de la famille des Secoviridés, le SMoV possède un génome constitué de deux ARN de polarité positive, chacun codant pour une grosse polyprotéine. Chez tous les Secoviridés caractérisés, les deux polyprotéines sont traitées en cis (polyprotéine ARN1) et en trans (polyprotéine ARN2) par une seule cystéine protéase (PRO), qui est liée à la PRO 3C des picornavirus. Alors que l’ARN1 code pour les protéines de réplication et la protéase de type 3C, la polyprotéine ARN2 contient normalement des domaines pour les protéines de transport et les protéines de la capside (MP et CP). La polyprotéine ARN2 d’isolats canadiens du SMoV comprend également une région C-terminale étendue possédant une capacité de codage de 70 kDa en aval du domaine CP présumé, ce qui constitue une caractéristique inhabituelle pour cette famille. Dans cette étude, nous avons cherché à caractériser le traitement protéolytique des polyprotéines du SMoV et à définir des domaines protéiques fonctionnels.MéthodesNous avons utilisé un essai avec réticulocytes de lapin in vitro et des polyprotéines de SMoV complètes ou tronquées pour caractériser les événements de clivage protéolytique. Les sites de clivage et les acides aminés conservés ont été prédits en utilisant les alignements des séquences d’acides aminés dérivés d’une collection d’isolats de SMoV et de virus apparentés, et ont été analysés par mutagenèse dirigée (mutation ou délétion ponctuelle).RésultatsComme il a été établi pour certains Secoviridés (c.-à-d. les népovirus), nous avons identifié cinq sites de clivage dans la polyprotéine ARN1 qui sont reconnus en cis par la protéase de type 3C. Un clivage primaire s’est produit entre les domaines de l’hélicase putative et VPg, tandis que d’autres clivages ont été clivés moins efficacement, du moins in vitro. La mutation de la cystéine prédite de la triade catalytique de la protéase de type 3C a aboli le traitement de la polyprotéine ARN1. Une séquence consensuelle de site de clivage a été déterminée comme étant AxEQ/G. La séquence consensuelle n’est pas présente dans la polyprotéine ARN2, bien qu’une séquence apparentée (AxEE/G) entre les domaines MP et CP prédits ait été clivée par des polyprotéines intermédiaires codées par l’ARN1 contenant le domaine PRO (par ex. VPg-PRO). Un événement de clivage supplémentaire a été détecté dans la polyprotéine ARN2 en aval du domaine CP, mais n’était pas dépendant de la protéase de type 3C codée par l’ARN1. La troncature C-terminale de la polyprotéine ARN2 ou la mutation ponctuelle d’un acide glutamique conservé (E1305) en alanine a empêché le clivage, ce qui suggère la présence d’une deuxième protéase virale dans la région Cterminale de la polyprotéine ARN2. Le clivage a également été réduit après l’ajout d’un mélange d’inhibiteurs de protéase à large spectre. La mutagenèse systématique a réduit l’événement de clivage à une séquence LDVKPAFPF, située immédiatement en aval du domaine CP prévu. Le clivage à ce site était un événement de cotraduction rapide qui ne s’est produit qu’en cis.ConclusionsContrairement à ce qui a été constaté pour d’autres Secoviridés caractérisés, nous montrons que le traitement des polyprotéines du SMoV nécessite deux protéases virales, une cystéine protéase de type 3C codée par l’ARN1 et une seconde protéase nouvelle codée par l’ARN2.