Transformation of isolated barley (Hordeum vulgare L.) microspores: II. Timing of pretreatment and temperatures relative to results of bombardment

Suite aux résultats présentés dans l’article I de cette série, les objectifs de cet article étaient d’établir la relation entre les prétraitements et les températures employés avant le bombardement biolistique, le stade du cycle cellulaire auquel se trouvaient les microspores au moment du bombardement et les fréquences de plantes transgénetiques homozygotes et hemizygotes d’orge (Hordeum vulgare L.). Des 104 plantes fluorescentes sélectionnées à l’aide du transgène GFP, 28 plantes étaient albinos et 76 plantes étaient vertes. Trente et une plantes vertes ont été confirmées transgéniques; les autres présentaient une expression transitoire de la protéine fluorescente verte ou de l’auto fluorescence. De ces 31 plantes, 23 provenaient d’embryons exprimant un haut niveau de fluorescence, et huit provenaient des 51 plantules à faible niveau de fluorescence. Des deux prétraitements utilisés pour induire l’embryogenèse, 24 des 31 plantes ont été produites après 21 jours à 4 °C, alors que seulement sept l’ont été après 4 jours à 4 °C en présence de mannitol. Lors des phases à forte pression osmotique (0,5 mol/L mannitol plus sorbitol) de 4 h avant et 18 h après le bombardement, deux régimes de température ont été évalué, soit 4 et 25 °C. Sur les 31 plantes transgéniques, 19 ont été produites suite au prétraitement à 25 °C pendant 4 h. Seize de ces plantes étaient haploïdes doublées (sept homozygotes pour le transgène), tandis que les autres trois étaient haploïdes. Des 12 plantes produites après le prétraitement de 4 h à 4 °C précédent le bombardement, neuf étaient haploïdes et trois haploïdes doublées, deux de ces dernières étant homozygotes. Les 12 plantes haploïdes ont été traitées à la colchicine pour produire des plantes haploïdes doublées transgéniques. Des deux promoteurs comparés, 30 plantes avaient le promoteur de l’actine et seulement une plante avait le promoteur 35S. L’utilisation de protéine arabinogalactan en milieu de culture a été très bénéfique puisque 29 des 31 plantes ont été obtenues en sa présence. Le meilleur procédé pour l’obtention de plantes transgéniques d’orge lors de cette étude combinait le prétraitement à forte pression osmotique à 4 ou 25 °C d’une durée de 4 h avant le bombardement, l’usage du promoteur de l’actine et l’emploi de protéine arabinogalactan dans le milieu de culture des microspores. Avec cette procédure, la fréquence de plantes transgéniques était 8 à 10 fois supérieure à celle obtenue dans les rapports précédents. Environ une plante transgénique par plat de Pétri a été produite, un rendement comparable à celui obtenu à l’aide d’Agrobacterium sur des structures multicellulaires dérivées de microspores.