Réalisation d’essais de fusion à haute résolution de l’ADN afin de détecter les gènes Rx1 et Rx2 pour la sélection à haut débit assistée par marqueurs de la résistance extrême au virus X de la pomme de terre chez la pomme de terre tétraploïde
Citation
Nie X, Dickison V, Brooks S, Nie B, Singh M, De Koeyer D and Murphy A. 2018. High resolution DNA melting assays for detection of Rx1 and Rx2 for high-throughput marker-assisted selection for extreme resistance to Potato virus X in tetraploid potato. Plant Disease 102:382-390 DOI:10.1094/PDIS-07-17-0968-RE.
Résumé en langage clair
Le virus X de la pomme de terre (PVX) est un virus commun d’importance qui touche la pomme de terre partout dans le monde, entraînant des pertes économiques chez les variétés vulnérables. Puisqu’il n’existe aucun traitement pour une plante infectée par un virus, le PVX est principalement maîtrisé par le recours à des variétés résistantes et à des pommes de terre de semence exemptes de virus. Par conséquent, la culture de variétés de pommes de terre qui résistent au PVX fait partie intégrante du programme d’amélioration de la pomme de terre d’Agriculture et Agroalimentaire Canada et d’autres programmes similaires dans le monde. La mise au point de variétés de pommes de terre résistant au PVX requiert encore l’inoculation du PVX dans les plantes afin de déterminer celles qui sont résistantes, un procédé long et inefficace appelé phénotypage. Dans le cadre de la présente étude, nous avons élaboré une méthode moléculaire permettant le criblage efficace et exact de deux gènes de résistance au PVX, Rx1 et Rx2, chez la pomme de terre. Nous avons évalué la nouvelle méthode en réalisant des essais sur 42 variétés de pommes de terre connues pour leur résistance ou leur sensibilité au PVX, ainsi que sur 600 individus issus de 12 croisements pour lesquels la réaction au PVX était inconnue, et nous avons pu démontrer que la méthode est exacte et très efficace. Les plantes pour lesquelles la FHR a donné un résultat positif pour le Rx1 étaient résistantes au PVX, tandis que celles pour lesquelles le résultat était négatif y étaient sensibles. Cette évaluation démontre que la nouvelle méthode permet de tester un grand nombre de croisements de pommes de terre rapidement, tout en diminuant la charge de travail et le temps requis pour mettre au point de nouvelles variétés résistantes.
Résumé
L’évaluation des méthodes existantes de PCR et d’électrophorèse sur gel pour la détection de Rx1 et Rx2, les gènes qui régissent indépendamment la résistance extrême au virus X de la pomme de terre (PVX), a indiqué que la paire d’amorces 5Rx1F/5Rx1R permettait la détection fiable de Rx1, tandis que la paire d’amorces 106Rx2F/106Rx2R détectait Rx2 malgré quelques réactions non spécifiques obtenues avec des clones ou des cultivars de pommes de terre ne possédant pas le gène Rx2. Toutefois, la méthode est longue et ne permet pas de différencier l’absence des gènes Rx1 et Rx2 d’une réaction de PCR qui n’a pas fonctionné. Une nouvelle paire d’amorces ciblant à la fois les gènes Rx1 et Rx2 ainsi que les gènes rx1 et rx2 a produit un amplicon pour tous les allèles. Quand la paire d’amorces a été combinée avec 5Rx1F/5Rx1R, des amplicons respectifs à chaque paire ont été produits, mais il n’était pas possible de les distinguer avec la méthode habituelle d’électrophorèse sur gel d’agarose. L’essai de fusion à haute résolution de l’ADN (FHR) a révélé deux profils de fusion distincts pour Rx1 et rx1. Des essais par PCR triplex, électrophorèse sur gel et FHR ont également été réalisés afin de détecter les gènes Rx1, Rx2, rx1 et rx2. L’efficacité des essais FHR a été confirmée pour des cultivars et des clones de pommes de terre au phénotype connu, ce qui démontre le potentiel de la méthode pour la sélection à haut débit des cultivars et des clones porteurs des gènes Rx1 ou Rx2. Des essais par PCR duplex et FHR menés sur plus de 600 individus issus de 12 croisements entre différents parents ont correctement révélé la présence ou l’absence du gène Rx1 chez chaque individu, ce qui a permis de prédire le phénotype exact. Les individus pour lesquels la FHR donnait un résultat positif pour le Rx1 présentaient une résistance extrême au PVX, tandis que ceux pour lesquels le résultat était négatif étaient sensibles au PVX. Le génotype de chaque parent et la présence possible du gène Nx chez deux parents porteurs du Rx1 sont également abordés dans l’étude.