Effects of mutations within surface-exposed loops in the pore-forming domain of the Cry9Ca insecticidal toxin of bacillus thuringiensis

Le domaine formateur de pores des toxines insecticides Cry de Bacillus thuringiensis est composé de sept hélices-α amphipatiques. Puisque l’on pense que la formation des pores s’accompagne de changements de conformation dans ce domaine, nous avons étudié le rôle possible de ses boucles interhélicales lors de cette étape cruciale à l’aide d’une série de doubles mutants de la Cry9Ca, lesquels partagent tous la mutation R164A décrite précédemment, en utilisant une combinaison de la modélisation par homologie, de bioessais et de mesures électrophysiologiques. Les mutations introduisaient, neutralisaient ou renversaient une charge électrique portée par un seul résidu de l’une des boucles du domaine I. Nous avons vérifié la capacité des vingt-huit doubles mutants de la Cry9Ca à dépolariser la membrane apicale d’intestins médians fraîchement isolés de larves de Manduca sexta en présence soit de suc intestinal ou d’un cocktail d’inhibiteurs des protéases, dans des conditions qui, d’après une étude antérieure, stimulent grandement la formation de pores par la Cry9Ca et son mutant simple R164A. La plupart des mutants ont conservé une toxicité et, selon les mesures électrophysiologiques, une capacité à former des pores qui est comparable à celle de la toxine parentale. Par contre, les mutants F130D, L186D et V189D se sont révélés très peu toxiques et pratiquement inactifs in vitro. Par ailleurs, le mutant E129A dépolarisait efficacement la membrane de l’intestin médian malgré une réduction considérable de sa toxicité, et le mutant Q192E présentait une réduction de la capacité à dépolariser la membrane tout en conservant une toxicité approchant celle du type sauvage. Ces résultats suggèrent que les conditions que l’on retrouve dans l’intestin médian des insectes, incluant la force ionique élevée, contribuent à réduire l’influence des charges de surface sur la capacité de la Cry9Ca et probablement d’autres toxines de Bacillus thuringiensis à former des pores à travers leur membrane cible.