A TaqMan real-time PCR assay targeting the cytochrome o ubiquinol oxidase subunit II gene for detection of several pathovars of Pseudomonas syringae
Citation
Xu, R. et Tambong, J.T. (2011). « A TaqMan real-time PCR assay targeting the cytochrome o ubiquinol oxidase subunit II gene for detection of several pathovars of Pseudomonas syringae. », Canadian Journal of Plant Pathology, 33(3), p. 318-331. doi : 10.1080/07060661.2011.600335
Résumé en langage clair
The identification and detection of eight pathovars of that bacteria Pseudomonas syringae, bacterial pathogens of several important agricultural plants, was achieved by TaqMan real-time polymerase chain reaction of a specific DNA fragment of the cytochrome o ubiquinol oxidase gene. Under optimal real-time PCR conditions, the selected primers and probe were specific for the detection of pathovars syringae, tomato, maculicola, tabaci, atropurpurea, phaseolicola, pisi and glycinea. Two pathovars coriandricola and morsprunorum) tested could be differentiated from the other eight due to a single nucleotide mismatch. Thirty other Pseudomonas strains and 20 non-Pseudomonas strains were negative. The real-time PCR assay detected 100 fg of DNA and 4.5×103 P. syringae colony forming units per millilitre (four cells per reaction). In growth chamber experiments, tomato plants were inoculated using strain DC3000 and assayed by TaqMan real-time PCR. Serial dilution of leaf extracts spiked with lambda DNA and processed by real-time PCR indicated the presence of inhibitors. A 1:10 dilution of the crude extract reduced threshold cycles to those of milliQ water spiked with the same amount of lambda DNA. The TaqMan real-time assay consistently detected the pathogen in inoculated tomato leaves after a 1:10 dilution of crude extracts. TaqMan real-time results were validated by dilution-plating of leaf extracts and conventional PCR using the same primer set. This assay offers real-time monitoring of the targeted amplicon with high specificity and sensitivity, with no post-amplification analysis needed. This reduces opportunity for contamination of the reaction mixtures with target DNA, making this real-time PCR assay more reliable than conventional PCR. However, for routine diagnosis of the detected pathovars under greenhouse or field conditions, optimization of the assay might be required.
Résumé
L’identification et la détection de huit pathovars de Pseudomonas syringae, agents pathogènes bactériens qui s’attaquent à plusieurs variétés de plantes économiquement importantes, ont été effectuées par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) quantitative en temps réel d’un fragment précis de l’ADN du gène cytochrome o ubiquinol oxydase. Dans des conditions idéales de PCR en temps réel, les amorces et les sondes choisies étaient typiques de la détection des pathovars syringae, tomato, maculicola, tabaci, atropurpurea, phaseolicola, pisi et glycinea. Deux pathovars testés (coriadricola et morsprunorum) ont pu être différenciés des huit autres à cause de la disparité d’un seul nucléotide. Trente autres souches de Pseudomonas et 20 de non-Pseudomonas étaient négatives. Les analyses effectuées par PCR en temps réel ont permis de détecter 100 fg d’ADN et 4.5 × 103 unités formatrices de colonies de P. syringae par millilitre (quatre cellules par réaction). Au cours d’expériences en chambre de culture, des plants de tomate ont été inoculés avec la souche DC3000 et analysés par PCR en temps réel. Une dilution en série d’extraits de feuilles, enrichie d’ADN lambda et traitée par PCR en temps réel, a révélé des inhibiteurs. Une dilution de 1:10 de l’extrait brut a réduit les cycles de seuil à ceux de l’eau Milli-Q enrichie avec la même quantité d’ADN lambda. L’analyse par PCR en temps réel a invariablement détecté l’agent pathogène dans les feuilles inoculées de tomate à la suite d’une dilution 1 : 10 des extraits bruts. Les résultats de la PCR en temps réel ont été validés par dilution et étalement des extraits de plante et par PCR traditionnelle en utilisant le même jeu d’amorces. Cette analyse permet le suivi en temps réel, très précis et sensible, de l’amplicon ciblé, et ce, sans avoir à