Optimization and validation of a reversed-phase high performance liquid chromatography method for the measurement of bovine liver methylmalonyl-coenzyme a mutase activity

Contexte
La méthylmalonyl‑CoA mutase (MCM) est une enzyme dépendante de l’adénosyl cobalamine qui catalyse l’interconversion de l’isomère 2R de la méthylmalonyl‑CoA en succinyl‑CoA. Chez les humains, la déficience de l’activité MCM attribuable à une anomalie de la formation intracellulaire de l’adénosyl cobalamine et de la méthyl cobalamine se traduit par un large éventail de manifestations cliniques qui vont de modérées à mortelles. Par conséquent, la MCM est un sujet abondamment traité dans la littérature. Pourtant, on ne s’entend pas sur la méthode à utiliser pour une surveillance fiable de son activité. Cette voie métabolique est largement sollicitée chez les ruminants parce qu’elle est indispensable à l’utilisation du propionate découlant de la fermentation ruminale. Les vaches laitières en lactation tirent le glucose principalement du propionate (substrat). Dans la présente étude, nous avons optimisé et validé une méthode de chromatographie liquide à haute performance en phase inversée (CLHP-PI) pour évaluer l’activité MCM dans le foie des bovins. Nous voulions principalement décrire les conditions requises pour l’optimisation de la reproductibilité de la méthode et déterminer la stabilité de l’enzyme et de ses produits durant l’entreposage et le traitement des échantillons.
Résultats
La spécificité de la méthode était bonne parce qu’aucun pic de l’extrait de foie n’a interféré aux temps de rétention correspondant à la méthylmalonyl‑CoA ou à la succinyl‑CoA. Nos résultats révèlent que la répétabilité de notre méthode était améliorée si nous comparons nos données de CLHP-PI à celles qui ont déjà été publiées. Avec 66 μg de protéines, le coefficient de variation (CV) intra‑analyse des activités spécifiques était compris entre 0,90 et 8,05 % et le CV interjour était de 7,40 %. Les conditions d’entreposage et de traitement (homogénat de tissu frais congelé par comparaison à homogénat frais de tissu plongé rapidement dans de l’azote liquide) n’ont pas modifié l’activité de l’enzyme. L’analyte a aussi été stable dans l’extrait de foie brut pour trois cycles de congélation-décongélation lorsqu’il a été entreposé à ‑20 °C, puis dégelé à la température ambiante.
Conclusion
La méthode améliorée permet d’étudier les effets des stades de lactation, de la composition de la ration et de la physiologie chez les bovins sur l’activité MCM pendant de longues périodes, notamment une lactation complète. Fait intéressant à signaler, cette méthode sensible et précise pourrait être utile à l’étude du rôle de la cobalamine dans les études expérimentales et les cas cliniques.