Molecular diagnostic tools for detection and differentiation of phytoplasmas based on chaperonin-60 reveal differences in host plant infection patterns

Les phytoplasmes (‘Candidatus Phytoplasma’ spp.) sont des bactéries transmises par des insectes qui infectent un vaste éventail de plantes, dont de nombreuses espèces agricoles d’importance. Ce type d’infection peut causer de lourdes pertes de rendement à cause de changements morphologiques qui nuisent dramatiquement au développement des inflorescences. La détection de l’infection par des phytoplasmes est habituellement fondée sur la séquence du locus de l’ARNr 16S–23S, qui permet d’identifier la souche en fonction des normes de classification des phytoplasmes actuellement en vigueur. Ces méthodes peuvent toutefois générer des produits de PCR > 1400 pb dont la séquence est moins divergente que celle des gènes qui codent des protéines, limitant dans certains cas la différenciation des souches. Nous décrivons ici une méthode permettant d’avoir accès à la séquence du gène codant la chaperonine-60 (cpn60) à partir d’une puce contenant l’ADN de nombreuses espèces de ‘Ca.Phytoplasma’. Deux paires d’amorces dégénérées ont été conçues d’après la diversité connue des séquences de cpn60 des ‘Ca.Phytoplasma’ spp. et utilisées pour amplifier des fragments du gène cpn60 de différents échantillons de référence et de tissus de plantes infectées. Quarante-trois séquences de cpn60 ont ainsi été déterminées. La méthode de PCR cpn60–électrophorèse s’est révélée très sensible comparativement à la PCR ciblant la séquence 16S-23S couplée à l’électrophorèse. La topologie de l’arbre phylogénétique généré à partir des séquences du gène cpn60 correspondait à celle publiée pour les gènes codant l’ARNr 16S. Nous avons utilisé les séquences du gène cpn60 pour concevoir un réseau d’hybridation constitué de microsphères fluorescentes couplées à des oligonucléotides, un moyen rapide de diagnostiquer et de caractériser les infections à phytoplasmes. Le test aux microsphères fluorescentes couplées à des oligonucléotides a révélé que les échantillons étaient infectés simultanément par deux sous-types de phytoplasmes. Ces outils ont permis de montrer que deux plantes hôtes, Brassica napus et Camelina sativa, avaient des profils d’infection phytoplasmique différents.