Expression, purification and analysis of an Arabidopsis recombinant CBL-interacting protein kinase3 (CIPK3) and its constitutively active form

La CIPK3 fait partie des protéines sérine-thréonine kinases interagissant avec les protéines analogues à la calcineurine B (CBL, pour calcineurin B-like), lesquelles jouent un rôle important dans de nombreux processus de développement et d’adaptation chez l’Arabidopsis. Les études portant sur des protéines de cette famille comme SOS2, PKS8 et PKS11 ont permis de mieux comprendre comment ces kinases interagissent avec leur substrat cible dans les processus de signalement et de réponse. Comme l’activité des enzymes SOS2, PKS8 et PKS11 est faible in vitro et que leur séquence d’acides aminés est homologue à celle de la CIPK3, nous avons présumé que l’activité enzymatique de la CIPK3 serait également faible. Pour accroître l’activité enzymatique de la CIPK3, nous avons préparé une forme active constitutive, la CIPK3T183D, par substitution de la Thr¹⁸³ par une Asp¹⁸³ dans la boucle d’activation. Les protéines que nous avons analysées ont été obtenues au moyen du système de fusion à la glutathione S-transférase (GST). Même si le CIPK3 et la CIPK3T183D étaient exprimées, elles ont été retrouvées dans des corps d’inclusion de concert avec trois protéines tronquées. Étant donné que les protéines tronquées avaient une affinité similaire pour la résine de liaison à la GST (protéine cible), nous ne pouvions pas utiliser la chromatographie d’affinité en une étape. Pour contourner le problème, nous avons employé le système de fusion des protéines à une étiquette d’histidine pour produire les protéines. Même si les protéines His-CIPK3 et His-CIPK3T183D s’accumulaient aussi dans les corps d’inclusion, elles étaient exprimées comme une seule espèce de protéine. Nous avons mis au point une méthode comprenant du SDS pour isoler et purifier les protéines de fusion His. Les enzymes His-CIPK3 et His-CIPK3T183D ainsi produites étaient bien purifiées et actives. Nous avons en outre constaté que l’activité kinase était presque décuplée (facteur de neuf) chez la His-CIPK3T183D, ce qui signifie que la substitution de la Thr¹⁸³ par l’Asp¹⁸³ dans la boucle d’activation de la CIPK3 a permis d’accroître l’activité de cette kinase.