Édition génique par CRISPR/Cas9 chez Medicago sativa, plante à reproduction allogame

L'ingénierie génomique guidée par l’ARN au moyen de la technologie CRISPAR (Clustered Regularly interspersed short palindromic repeats [courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées])-Cas9 permet une variété d'applications chez les plantes. L’utilisation et la validation de la technique CRISPR dans un génome multiplexe, comme celui de Medicago sativa (luzerne) permettra des avancées majeures dans l'amélioration de cette plante. Dans cette étude, nous avons utilisé la technique CRISPR/Cas9 pour muter le gène de la luzerne SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE 9 (SPL9). En raison de la complexité du génome de la luzerne, nous avons d'abord utilisé la PCR numérique en gouttelettes (ddPCR, pour droplet digital PCR) pour le criblage à haut débit de grandes populations des plantes modifiées par CRISPR. D’après les résultats des taux d'édition génique obtenus avec le criblage ddPCR, l’ADN des plantes chez lesquelles les taux d’édition génique étaient relativement élevés a fait l’objet d’une analyse plus poussée : digestion par des enzymes de restriction et amplification des fragments par PCR. Les produits de la PCR contenant le locus cible du petit ARN guide ont ensuite été sous-clonés et séquencés de manière à ce que nous puissions vérifier l'édition génique. En résumé, nous avons appliqué avec succès la technique CRISPR/Cas9 pour éditer le gène SPL9 dans un génome multiplexe, ce qui nous a permis de mieux comprendre les possibilités d'application de cette technologie dans la sélection de la luzerne. L'efficacité globale de la technologie CRISPR/Cas avec le génome polyploïde de la luzerne était inférieure à celle observée avec d'autres génomes végétaux moins complexes. Il faudra donc perfectionner davantage cette technologie pour améliorer l'efficacité de l'édition génique chez la luzerne.