Detection, identification and differentiation of corn pathogen pantoea stewartii subspecies by membrane-based multi-gene oligonucleotide array
Citation
Nejjari, M., Xu, R., et Tambong, J.T. (2015). « Detection, identification and differentiation of corn pathogen pantoea stewartii subspecies by membrane-based multi-gene oligonucleotide array. », Jurnal Teknologi, 77(24), p. 123-129. doi : 10.11113/jt.v77.6719
Résumé en langage clair
Pantoea stewartii subsp. stewartii (Pss) is mostly known as the Stewart’s wilt pathogen of sweet corn and it is classified as a quarantine bacterium, requiring certification of grain shipments to over 60 countries. It is found throughout the Corn Belt in the United States, Canada as well as other countries in South and Central America, Europe, and Asia. The conventional molecular methods of identification, reported to date, are not specific enough to differentiate Pss from Pantoea stewartii subsp. indologenes (Psi) in infected corn leaves and seeds. In this study, we have developed the first multi-gene array for accurate detection, identification and differentiation of Pss from Psi and Pantoea. The technique consisted of multiplex (16S rRNA,leuS, gyrB, rpoB, cps PCR amplifications using universal and specific primers in a single reaction, followed by the hybridization of the digoxigenin-labeled amplicons to 22 specific oligonucleotide probes (19- to 24-mers) immobilized on a nylon membrane. The reliability of the array was tested on 50 bacterial strains consisting of Pantoeaspecies, closely- and distantly-related bacterial genera and species. The hybridization signals were consistent and reproducible and the specificity for the identification of pure cultures was 100%. In growth chamber-inoculated and naturally-infested corn leaves and seeds, the array detected the pathogen in all infected plants. We conclude that the reported multi-gene DNA array is a reliable tool for routine identification and differentiation of Pss from Psi and other Pantoea species in pure cultures and infected corn leaves and seeds
Résumé
Pantoea stewartii subsp. stewartii (Pss) est surtout connu comme l’agent de la maladie de Stewart chez le maïs sucré et est classé comme organisme bactérien de mise en quarantaine nécessitant une certification des expéditions de céréales dans plus de 60 pays. On retrouve cette bactérie dans la « corn belt » des États-Unis, au Canada ainsi qu’en Amérique centrale et en Amérique du Sud, en Europe et en Asie. Les méthodes classiques de biologie moléculaire connues à ce jour pour identifier les bactéries ne sont pas assez discriminantes pour distinguer entre Pss et Pantoea stewartii subsp. indologenes (Psi) dans les feuilles et les graines du maïs infecté. Dans cette étude, nous avons mis au point la première puce multigénique pour la détection, l’identification et la différentiation de Pss, de Psi et des Pantoea. La technique consiste à amplifier par PCR multiplexe les gènes suivants : ARNr 16S, leuS, gyrB, rpoB, cps avec des amorces universelles et spécifiques en une seule réaction, suivie de l’hybridation des amplicons marqués à la digoxigénine avec 22 sondes d’oligonucléotides spécifiques (19- à 24-mères) immobilisées sur une membrane de nylon. La fiabilité de la puce a été vérifiée avec 50 souches bactériennes constituées d’espèces de Pantoea, ainsi que de genres et d’espèces étroitement et vaguement apparentés. Les signaux d’hybridation se sont révélés constants et reproductibles, et la spécificité d’identification des cultures pures était de 100 %. Dans les feuiIles et les graines du maïs cultivé et inoculé en chambre de croissance de même que dans celles du maïs infecté naturellement, la puce a permis de détecter le pathogène dans toutes les plantes infectées. Nous concluons que la puce à ADN multigénique est un outil fiable pour l’identification de routine et la distinction entre Pss et Psi et d’autres espèces de Pantoea en cultures pures provenant de feuilles et de graines de maïs infecté.