Genetic typing of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains isolated from 14 cows shedding high levels of MAP in the Provinces of Quebec and Ontario Herds

Citation

Byrne, A., O. Severine, T. Cochard, K. Tahlan, F. Biet, and N Bissonnette. 2022. Genetic typing of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains isolated from 14 cows shedding high levels of MAP in the Provinces of Quebec and Ontario Herds. 15th International Colloquium on Paratuberculosis, Dublin, Irland, June 12-16th 2022.

Plain language summary

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) est la bactérie responsable de la maladie de Johne chez les ruminants. Cette maladie se manifeste par une inflammation de l’intestin qui s’apparent à la maladie de Crohn chez l’humain. On la retrouve notamment dans les troupeaux laitiers. Cette maladie incurable est chronique et évolue parfois lentement (5-7 ans). Par contre, sa progression est imprédictible. Durant cette période sous-clinique (avant de voir apparaître les symptômes), les animaux infectés pourront excréter MAP dans les fèces, permettant à la bactérie d’infecter d’autres animaux. Au Canada, on connaît l’existence de plusieurs foyers d’infection, appelé aussi souches du pathogène MAP. Cette science qui cherche à comprendre l’origine et la transmission des souches se nomme l’épidémiologie. Afin de retracer le mouvement des souches, on fait appel à des techniques d’épidémiologie moléculaire basées sur la PCR. Il s’agit de détecter des portions de la bactérie, d’en faire la lecture par séquençage ou autre méthode de discrimination, pour les différentier. On cherche ainsi à établir le profil distinctif ou une signature moléculaire de chaque foyer d’infection du MAP. Des techniques très répandues permettent d’examiner les cibles réparties dans tout le génome du MAP. Ces techniques sont connues sous le nom de MIRU-VNTR ou de SSR. En gros, l'analyse de fragments du MAP qui contiennent des répétitions de séquences courtes spécifiques permet de différentier la nature des foyers d’infection.
Une considération importante est la présence d'infections à souches multiples, i.e. issues de foyers distincts. L’existence de souches multiples chez les animaux atteints de paratuberculose est un phénomène qui n’avait pas été étudié. Bien qu’il soit rapporté pour d’autres infections, notamment la tuberculose chez l’humain, il n’avait pas été étudié chez la vache. Dans cette étude, nous avons sélectionnés 14 vaches atteintes de paratuberculose dans trois fermes, identifiées en raison des tests diagnostiques sanguin (ELISA) et de la PCR fécal, tous deux positifs pour la maladie. À l’aide de la culture bactérienne, on a identifié les souches à partir de l’analyse des fèces, car les vaches excrétaient le MAP dans leurs fèces. À l’instar de caractériser une seule souches par vache, 10 souches furent isolées par vache. Un total de 139 souches ont été analysées. La culture individuelle des différentes souches a permis de faire l’analyse de leur signature moléculaire. Les résultats de l’analyse par la technique MIRU-VNTR étaient identiques pour tous. Cependant, les résultats de l'analyse des fragments SSR ont montré jusqu'à 9 modèles uniques chez chaque animal suggérant que des foyers d’infection multiples peuvent être présents.
Les résultats de cette analyse montrent que le SSR peut discriminer les foyers d’infection avec une plus grande capacité de résolution que la technique issue des MIRU-VNTR. On ne connaît pas l’étendue du phénomène dans les troupeaux mais la présence de ce phénomène dans l’ensemble des 14 vaches analysées laisse croire que le phénomène serait répandu. De toujours, cette maladie est imprédictible pour voir apparaître chez certaines vaches infectées des symptômes de progression rapide de la maladie. Sachant que plusieurs foyers d’infection sont présents, la question se pose à savoir si l’infection par une souche additionnelle puisse influencer la progression de la maladie chez certains animaux.

Abstract

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the causal bacteria for Johne’s Disease, a chronic granulomatous enteritis affecting both wild and domestic ruminants. During the subclinical stage of infection, infected animals may excrete MAP in feces, allowing disease to spread undetected throughout the herd. Epidemiological studies have used PCR-based techniques to examine loci found throughout the genome known as MIRU-VNTR. Additional studies have used DNA fragment analysis performed on specific short sequence repeats (SSRs), which also discriminate strains. An important consideration is the occurrence of mixed strain infections (MSIs), which may exhibit different phenotypes or antigens, complicating the immune response. Instances of MSIs are typically considered as rare events, with few studies successfully identifying MSIs within MAP host animals. This study examines strains of MAP isolated from 14 cows and evaluates molecular methods for rapid MSI identification, notably using MIRU-VNTR and SSR-based fragment analysis. Cows were selected from three farms and were categorized based on blood ELISA and fecal ISMAP02 qPCR results. Strains of MAP (10 per cow) were selected on solid cultures. For each strain, an axenic liquid culture was prepared, totalling 139 isolates. DNA extracted from each strain was examined using 8 MIRU-VNTR and 2 SSR loci. The MIRU-VNTR analysis results were identical across all isolates. However, the results from the SSR fragment analysis showed up to 9 unique patterns within each animal suggesting that MSIs may be present. As the rate of change of SSR could be independent of the rate of chromosomal evolution, further work will include whole-genome sequencing, which provides the greatest resolution for differentiation between strains. Results of this analysis show that SSR can discriminate strains with greater resolving ability than MIRU-VNTR. Our study suggests that MSI events may be overlooked within herds and should be considered in a phylogenetic context for affirming epidemiological connections.

Publication date

2022-06-12

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